CAR-T细胞治疗                       

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞是经过基因工程改造以产生用于免疫治疗的人为干预T细胞受体的T细胞。CAR-T细胞是经精心设计，可为T细胞提供靶向特定抗原新能力的受体蛋白。要如需查看我们的CAR-T治疗工作流程，请单击此处。       

CAR-T细胞治疗的流程

1. 获取患者T细胞

2. 体外制备特殊CAR-T细胞，包括T-细胞的活化，CAR-T细胞的扩增和质控。

3.治疗流程

治疗前的化疗，CAR-T细胞回输和患者临床并发症监测

4. 后续的治疗

(a)使用CRISPR/ cas9将CAR基因定点整合到TRAC基因位点。上图代表TRAC基因位点，中图代表rAAV6载体的序列中间加载CAR基因座，两侧有同源臂; 下图代表编辑过的TRAC基因位点。(b) TRAC定点整合CAR后第4天TCR/CAR流式图。(c, d) CAR+阳性T细胞的平均荧光强度(MFI) 和CAR MFI方差系数 (n=12个独立实验，6个供体)。（e）小鼠生存曲线分析。(f-j)携带NALM-6细胞系的小鼠注输1×105 CAR-T细胞(n=7 /组;每个点代表一只老鼠)，并在注射后第10天和第17天将小鼠安乐死取骨髓进行CAR- T细胞和NALM-6的流式分析和计数(如e图所示)。(f) CAR-T细胞。(g)肿瘤(GFP+CD19+)细胞。(h) CAR-T细胞与肿瘤的比例。(i) CAR-T细胞第17天记忆表型(CD62L−CD45RA−)和效应表型(CD62L−CD45RA+)的百分比。(j)表达衰竭标记的CAR-T细胞百分比;第17天用流式细胞术进行量化。 * P < 0.05, * *P < 0.01, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001。

CAR-T细胞的细胞因子产生和细胞毒性

靶向EIIIB纤维连蛋白的CAR-T细胞在体内减缓B16黑色素瘤的生长。（A)用靶向EIIIB的特异性B2 CAR来转导T细胞，通过mCherry表达来测量转导效率。用重组EIIIB-GST孵育细胞，用兔抗gst和兔抗A647探针检测配受体结合。(B) B2 CAR - T细胞在对配体有识别的反应的细胞中表现出细胞毒性。B2 CAR-T细胞与表达EIIIB纤维连接蛋白结构域(AEC FN+/+)或缺乏EIIIB纤维连接蛋白结构域(AEC FN−/−)的主动脉内皮细胞(AEC)共培养。(C)小鼠在第0天接种B16肿瘤，在第4天、第15天和第20天接种B2 CAR-T细胞(n = 10)。(D)测量单个小鼠的肿瘤面积。生存曲线显示各组存活率(P = 0.0001)接受B2 CAR - T细胞治疗的小鼠存活率提高。扫描电镜如图所示。(E) RAG−/−小鼠接种B16肿瘤，并在第4天用B2 (n = 4)或1B7 CAR - T细胞(n = 3)治疗。使用B2 CAR-T细胞治疗的RAG−/−小鼠没有表现出生存改善或延缓肿瘤生长。扫描电镜如图所示。(F) MC38表达较低水平的EIIIB。

体内CAR-T药效实验

(A) NSG小鼠皮下接种2 ×10^6 NALM6细胞。接种14d后，小鼠随机分为3组，静脉注入30 × 10^6个CAR-T细胞。(B) 计量经T1或T9 CAR-T细胞治疗后小鼠的肿瘤体积。(C) CAR-T细胞治疗小鼠(n = 5) 的生存曲线图。T1与T9 CAR-T细胞治疗小鼠准确的P值通过log-rank分析显示。(D)在CAR-T回输后的指定天数内，显示治疗小鼠外周血中CAR-T细胞占比的代表性散点图。(E) CAR-T细胞输注后第8天和第12天，治疗小鼠外周血中CAR-T细胞的百分比(n = 5只小鼠)。(F) CAR-T细胞输注后第12天肿瘤浸润CAR-T细胞频率的代表性散点图(G) CAR-T细胞输注后第12天肿瘤浸润CAR-T细胞的百分比(n = 5只小鼠)。(H) NSG小鼠皮下接种3 × 106 HepG2细胞。14d后，小鼠随机分为3组，静脉注入10 ×106个CAR-T细胞。(I)接受了24天T细胞或PBS治疗的小鼠的代表性肿瘤图像。(J)用所示的T细胞或PBS处理的HepG2异种移植小鼠的生长曲线(n = 5只小鼠)。380/5000 

(K)流式图(左图)和(L)汇总数据(右图);n = 4只小鼠)显示CAR-T输注后指定天数内，接受治疗小鼠外周血中CAR-T细胞的频率。(M, N) CAR-T细胞输注后第12天肿瘤浸润CAR-T细胞百分比(N = 5只小鼠)。数据以平均值±标准差表示。* * * * P < 0.05和P < 0.001。

参考文献

1. Li, H., Huang, Y., Jiang, DQ. et al. Antitumor activity of EGFR-specific CAR T cells against non-small-cell lung cancer cells in vitro and in mice. Cell Death Dis 9, 177 (2018). https://doi.org/10.1038/s41419-017-0238-6

2. Eyquem, Justin; Mansilla-Soto, Jorge; Giavridis, Theodoros; van der Stegen, Sjoukje J. C.; Hamieh, Mohamad; Cunanan, Kristen M.; Odak, Ashlesha; Gönen, Mithat; Sadelain, Michel (2017). Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature, 543(7643), 113–117. doi:10.1038/nature21405 

3. Xie, Yushu Joy et al. “Nanobody-based CAR T cells that target the tumor microenvironment inhibit the growth of solid tumors in immunocompetent mice.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America vol. 116,16 (2019): 7624-7631. doi:10.1073/pnas.1817147116

4. Liu, L., Bi, E., Ma, X. et al. Enhanced CAR-T activity against established tumors by polarizing human T cells to secrete interleukin-9. Nat Commun 11, 5902 (2020). https://doi.org/10.1038/s41467-020-19672-2