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派思维新 | 动物模型构建助力炎症肠病药物的研发

来源: | 作者:派思维新 | 发布时间: 2024-11-07 | 89 次浏览 | 分享到:

01.前言

由于现代人生活节奏快、压力大，饮食不规律，消化道也随之产生了问题，而肠道作为我们人体内最容易生病的消化器官，我们对它又有多少关注呢？有调查显示，全球有超过1000万人罹患炎症性肠病，我国的发病率为1.77/10万~3.14/10万，其中儿童炎症性肠病患者占比高达1/4[1]，病程迁延难愈，易反复发作，常伴随终身。而长期、反复的慢性肠炎，有可能导致结肠癌的发生。
据国家癌症中心发布的2022年中国癌症统计结果，2016年，全国结直肠癌新发病例超过40万，已经成为我国的第二大癌症。2000年后，全国结直肠癌发病患者数目直线上升，在男性当中的死亡率也呈逐年上升趋势[2]。
由于结直肠癌早期症状和肠炎十分相似，并不能引起足够的重视，往往要到晚期才能被诊断出来，它也因此被称为“沉默的杀手”。据统计，早期结直肠癌5年生存率仅为90%左右[3]，但是只有不到一半的病例能够在这个阶段被发现，大多数结直肠癌发现即晚期。
在肠炎早期就开始干预治疗，可以有效的避免肠癌的发生。因此，研究治疗炎症性肠病至关重要。



1.1什么是炎症性肠病

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种以消化道炎症和黏膜破坏为特征的自身免疫性疾病，主要分为克罗恩病（Crohn’s disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）两种类型[4-6]。免疫失衡、肠道屏障通透性的改变、微生物群的状态以及饮食与生活方式等环境因素的变化都对该病的发生和发展有很大影响。

CD和UC表型区别


02.IBD治疗现状

2.1IBD临床表现


IBD为累及回肠、直肠、结肠的一种特发性肠道炎症性疾病[7]。临床表现为腹泻、腹痛，甚至可有血便[8]。溃疡性结肠炎是结肠黏膜层和黏膜下层连续性炎症[9]，疾病通常先累及直肠，逐渐向全结肠蔓延，克罗恩病可累及全消化道，为非连续性全层炎症，最常累及部位为末端回肠、结肠和肛周[10-11]。


2.2IBD发病机制

IBD目前病因及发病机制尚不明确，随着研究的不断深入，人们发现在IBD的发病过程中，细胞因子的作用和免疫调节的紊乱是极其重要的因素。


2.3研究进展


在过去的20年中，IBD的治疗领域取得了许多进展，其中抗肿瘤坏死因子（anti-TNF）药物最早获批用于治疗中重度IBD的生物制剂[12]，已成为中重度UC和CD治疗的基石，减少了手术干预的需求。随后，各种免疫调节疗法被开发出来，如TNF抗体药物（如英夫利昔单抗、阿达木单抗、培塞利珠单抗）、白细胞介素(IL)抑制剂（如乌司奴单抗）、整合素受体拮抗剂（维得利珠单抗、那他珠单抗、Etrolizumab、Ontamalimab）、JAK抑制剂（Filgotinib、Upadacitinib)和S1P受体调节剂（Ozanimod、Etrasimod）[13]。


免疫调节药物在炎症性肠病中的作用机制[13]


目前处于临床研究状态的国产IBD新药可大致分为4个种类：生物制剂、小分子、干细胞和中药。如下表：

IBD国产在研新药[14]

目前关于IBD确切发病机制尚不明确，研究指出，该疾病发展可能与遗传、免疫失调、环境和肠道菌群等因素有高度相关。临床上尚无对IBD的治疗效果理想的药物，寻找治疗IBD的新方法，提高IBD的治疗效果，一直是近年来的研究热点。

因此，建立IBD动物模型对于阐明IBD的病因和发病机制，从而达到有效防治的目的，具有重要的现实意义。


03.化学诱导的结肠炎动物模型

目前已经开发出动物模型，主要可以分为以下几类：

恶唑酮（OXZ）或三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的IBD模型

造模机制：OXZ和TNBS均具有半抗原性质，可诱导T细胞介导的免疫反应。细胞介导的2型（Th2）免疫反应，白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-5（IL-5）的产生明显增加，并伴有体质量减轻、腹泻、溃疡和大肠上皮细胞减少。

模型特点：TNBS诱导以IL-12驱动的TH1反应为主，形成横向进展的炎症，导致透壁结肠炎，TNBS可诱导克罗恩氏病（CD）的临床前模型。恶唑酮诱导的免疫反应是Th2介导的，会导致弥漫性结肠炎症。用于研究皮肤中的迟发型超敏反应，也用于评估靶向Th2介导机制的药物。

造模方法：小鼠背部脱毛，涂抹1%的TNBS溶液150μL预致敏，七日后麻醉后小鼠，将导管插入直肠100px，将100μL的1.5%TNBS缓慢注射进入小鼠直肠内，倒置1min，以防止结肠内液体流出，造模后通过DAI评分判定造模情况。


葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的IBD模型

造模机制：DSS诱导小鼠肠炎模型是目前应用最广泛的化学诱导小鼠IBD模型。通过在饮用水中溶解DSS诱导急性溃疡性肠炎或慢性结肠炎，破坏小鼠肠道上皮细胞，非特异性免疫细胞释放细胞因子，最终导致粘膜屏障完整性被破坏。虽然该模型最早的改变是结肠隐窝逐渐破裂，但在后期恢复阶段，巨噬细胞和分化的CD4+T细胞在肠黏膜固有层基础部分的伤口愈合区变得更加突出。动物表现出明显的体重减轻、稀便、便血等症状，其临床症状和病理特征与人类溃疡性结肠炎非常相似。

模型特点：DSS所致的UC模型的特点取决于以下几个因素，具体包括DDS 剂量（通常为 1%～5%）、持续时间（急性或慢性）、动物种属（C3H/HeJ 和BALB/ c小鼠更易受感染）、动物的性别（雄性小鼠更易受感染），以及动物的微生物环境（在无菌（GF）级或无特定病原体（SPF）级环境下受感染不同。据报道，DSS引起的UC模型应用于化合物、基因/细胞治疗和微生物干预的药效学研究并获得较好的效果。

造模方法：DSS造模方法简单，通常采用2.0%～5.0%DSS水溶液供造模组小鼠自由饮用7天，对照组小鼠则饮用正常高压灭菌水以造急性结肠炎。给造模组动物饮用2.0%～5.0%DSS溶液7天，第8天将DSS溶液更换为正常饮用水，持续14天后，重复前面的步骤2-4次以造慢性结肠炎。


醋酸诱导的IBD模型

造模机制：直肠内注射稀醋酸可以对黏膜上皮造成化学损伤，导致上皮坏死、血管损伤而使血管通透性增加，从而诱发IBD表型。

模型特点：该模型导致直肠溃疡和黏膜损伤有时可延伸到肠黏膜固有层，在小鼠模型中在几天内开始愈合，但在大鼠模型中需要几周。醋酸所致结肠炎的优点是成本低，给药方便。

造模方法：大鼠麻醉后，将导管插入直肠6-200px，缓慢注入4%醋酸，保持接触30s，然后用5ml生理盐水冲洗2次，倒置30秒，以防止结肠内液体流出。


基因修饰IBD动物模型

近年来随着转基因和基因敲除技术的发展，可以通过基因工程进行造模的优点是靶点针对性强，可以通过特定的靶点（如免疫相关和肠道黏膜屏障相关）设计相应的IBD动物模型。

IL-7转基因（Tg）小鼠模型


IL-7Tg小鼠在8～12周龄出现直肠脱垂和间歇性肠道出血，直肠侵蚀、杯状细胞丢失和偶见隐窝脓肿。黏膜淋巴细胞IL-7R的上调与UC的进展有关。因此，通过IL-7 Tg小鼠模型有助于了解T细胞介导的结肠炎发病机制，可为针对T细胞功能靶点的干预治疗提供理论依据。


IL-2 KO 小鼠模型


IL-2 KO小鼠在4周龄前，存活和发育正常，此后死亡率达50%。其余鼠在CV环境中饲养至6周龄时，出现外显率为100%的结肠炎症但在GF环境中不出现。这种炎症的临床症状和组织学特征与人UC有明显的相似之处，包括隐窝脓肿、溃疡和杯状细胞丢失。SPF环境下小鼠只在17～20周龄时才开始出现结肠炎症。


Gαi2 KO小鼠模型


Gαi2 KO小鼠在5～7周表现出明显的致死性弥漫性结肠炎表型，与UC 具有相似的临床表现和组织病理学特征，包括结肠增厚、淋巴细胞和中性粒细胞浸润、隐窝和杯状细胞丢失以及隐窝脓肿。
T cell receptor α（TCRα）基因敲除（KO）小鼠模型
TCRα KO小鼠自发地发展为慢性结肠炎，该模型是由Th2型免疫反应介导，与人UC相似，其炎症模式主要局限于结肠黏膜。在SPF环境中饲养的 TCRα KO小鼠出现自发性结肠炎，但在GF或普通环境（conventional，CV）中则不发生。当SPF出生的TCRα KO小鼠随后转移到CV环境中时，小鼠轻度结肠炎的症状出现减轻。这支持了早期生活暴露于环境微生物可以防止以后生活中的结肠炎风险的假说。


Wiskott-Aldrich综合症蛋白（WASP）KO 小鼠模型


与人类WASP缺乏相似，129 SvEv背景的WASP KO小鼠从4月龄时出现自发性结肠炎，在6月龄时可观察到完全外显率，该模型炎症与人类UC相似，研究发现WASP KO小鼠先天免疫细胞在破坏黏膜调节中也起着重要作用。该模型用于研究IBD发病机制的优势是Th2型细胞因子升高，与人类疾病相似，有相同基因缺陷的一部分患者也患有结肠炎，均存在调节性 T 细胞和天然免疫细胞功能异常。


multi-drug resistance gene-1a，(Mdr1a）KO 小鼠模型


Mdr1a KO小鼠在SPF环境下饲养约有25%动物在8～36周龄时发生结肠炎，而在GF环境中不发生。该模型的组织学表现包括黏膜增厚和杯状细胞丢失，同时伴有结肠内的隐窝脓肿和溃疡。



小结

不同的肠炎模型都有优缺点，在使用不同的模型评估不同药物的体内疗效时，需关注以下方面：

①临床上一般是在疾病确诊后进行药物治疗。在动物模型中预防给药并不能代表预期药物的临床使用，虽然预防给药能研究药物的作用机制，但它们缺乏与肠炎相关的复杂性；

②与急性模型比较，在长期慢性模型中进行药效学试验，可能更能反映与人类疾病相关的复杂的免疫表现；

③依赖于微生物组存在的模型与临床肠炎相关性较好，虽然很可能表现出与临床肠炎病理相似的特征，但在不同的实验室可能缺乏可重复性；

④动物模型与影响药物治疗方法的相关性。阐明靶点作用机制，以及试验终点与临床终点的相关性，在动物模型的选择中至关重要。



04.派思维新IBD肠炎模型案例研究分享

Case Study: DSS induced IBD model

Aim：To validate the effect of Dex on DSS induced IBD model in C57BL/6 mice.

Animal：C57BL/6 mice, female, 6 - 8 weeks,18-20g.

Reagent：DSS , Dex


Aim：To validate the effect of CsA on DSS induced IBD model in C57BL/6 mice.

Animal：C57BL/6 mice, female, 6 - 8 weeks,18-20g.

Reagent：DSS , CsA


Aim：To validate the effect of CsA on DSS induced IBD model in SD rat.

Animal：SD rat, female, 6 - 8 weeks,180-200g.

Reagent：DSS , CsA



Case Study: TNBS induced IBD model

Aim：To validate the effect of SASP on TNBS induced IBD model in C57BL/6 mice.

Animal：C57BL/6 mice, female, 6 - 8 weeks,18-20g.

Reagent：TNBS , SASP



Case Study:CD4+CD45RB high T cells induced IBD model

Aim：To validate the effect of MT-1303 on CD4 + CD45RB high T cells induced IBD model in CB-17 SCID mice.

Animal：CB-17 SCID, female, 6 - 8 weeks,18-20g.

Reagent：CD4 + CD45RB high T cells , MT-1303



参考文献：

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