RT-qPCR

RT-qPCR由普通PCR技术发展而来，它是在传统PCR反应体系中加入荧光化学物质（荧光染料或者荧光探针），根据各自不同的发光机制实时检测PCR退火、延伸过程中荧光信号变化来计算PCR每个循环中产物的变化量，目前最常见的方法为荧光染料法和探针法。

荧光染料法：

一些荧光染料如SYBR Green Ⅰ，PicoGreen，BEBO等，它们本身不发光，但结合于dsDNA的小沟后会发出荧光。所以当PCR反应刚开始时机器并不能检测到荧光信号，当反应进行到退火-延伸（二步法）或者延伸阶段（三步法），此时双链打开，在DNA聚合酶的作用下新链合成，荧光分子就结合于dsDNA的小沟中并发出荧光，随着PCR循环数的增加越来越多的染料与dsDNA结合，荧光信号也不断的增强。以SYBR Green Ⅰ为例。

探针法：

Taqman探针是最为常用的一种水解探针，在探针的5’端存在一个荧光基团，通常为FAM，探针本身则为一段与目的基因互补的序列，在探针的3’端有一个荧光猝灭基团，根据荧光共振能量转移原理(Förster resonance energy transfer， FRET)，当报告荧光基团（供体荧光分子）和猝灭荧光基团（受体荧光分子）激发光谱重叠且距离很近时（7-10nm），供体分子的激发可以诱发受体分子发荧光，而自身荧光减弱。所以PCR反应开始，探针游离于体系中完整存在时，报告荧光基团并不会发出荧光，当退火时，引物和探针结合于模板，在延伸阶段，聚合酶不断的合成新链，由于DNA聚合酶具有5’-3’核酸外切酶活性，到达探针时，DNA聚合酶就会将探针从模板上水解下来，报告荧光基团和猝灭荧光基团分开，释放荧光信号。由于探针和模板存在一对一的关系，所以在试验的精度和灵敏度上，探针法都要优于染料法。